|
|
|
Identifikasi Mycobacterium tuberkulosis berdasarkan:
1. Waktu pertumbuhan
Kuman Mycobacterium tuberculosis tumbuh setelah 2-3 minggu dengan koloni yang timbul dari permukaan, berwarna kuning atau krem.
2. Pembentukan pigmen
3. Tes biokimia
· Merah Netral: hasil (+) berarti Mycobacterium tuberculosis
· Tes Niasin: hasil (+) berarti Mycobacterium tuberculosis
· Nikotimanida 5000 mikrigram (ug)/ml: Hasil (-) berarti Mycobacterium tuberculosis
· Arysulfatasa: hasil (-) berarti Mycobacterium tuberculosis
· Reduksi nitrat: hasil bisa (+) atau (-) berarti Mycobacterium tuberculosis
· Hidrolisis Tween-80 selama 10 hari: hasil (-) berarti Mycobacterium tuberculosis
· Pertumbuhan pada 4 (p)–nitro benzoic acid 500 ug/ml: hasil tumbuh, berarti Mycobacterium tuberculosis
· Pertumbuhan pada thiacetazone: hasil tumbuh, berarti Mycobacterium tuberculosis
2. Suhu pertumbuhan. Tumbuh pada suhu 35-37 OC
Tes resistensi
Yaitu tes kepekaan kuman tuberkulosis terhadap obat-obatan antituberkulosis. Penting dilakukan untuk pengobatan yang tepat. Obat-obat yang dicoba termasuk streptomisin, INH, PAS, etambutol, pirazimanida, rifampisin dan kanamisin yang biasa digunakan di klinik.
Tes resistensi dilakukan :
· secara langsung apabila jumlah kuman di dalam sputum cukup banyak yaitu : ≥ bronkhorst III. Pada umumnya dilakukan secara tidak langsung.
· secara tidak langsung yaitu kuman diisolasi dahulu sebelum dilakukan tes.
Metode tes resistensi
· Absolut, patokannya kadar hambatan minimum kuman terhadap obat tertentu. Hasil > KHM: resisten
· Resintance ratio, perbandingan dengan kuman standar H37Rv. Hasil sama berarti sensitif
· Propotion methode, persen populasi kuman telah resisten terhadap obat tertentu. Hasil: proporsi resisten rendah obat dapat digunakan untuk terapi.
Cara yang lazim digunakan kombinasi resistance ratio dan propotion methode dengan hasil:
Obat anti TB A : B x H37Rv C %
B : apabila > 4 x dianggap resisten
C : Apabila > 1% dianggap resisten
Pemeriksaan sputum secara mikroskopis langsung
1. Pemeriksaan sputum secara mikroskopis merupakan pemeriksaan yang paling efisien, mudah dan murah. Pemeriksaan bersifat spesifik dan cukup sensitive.
2. Mycobacterium tuberculosis:
· Berbentuk batang
· Sifat tahan terhadap penghilangan warna dengan asam dan alkohol karena itu disebut Basil Tahan Asam (BTA)
· Dapat dilihat di mikroskop bila jumlah kuman paling sedikit 5000/ml sputum. Sputum yang baik diperiksa adalah sputum kental dan purulen warna hijau kekuningan. Volume 3-5 ml tiap pengambilan.
3. Tujuan pemeriksaan sputum:
· Menegakkan diagnosis dan menentukan klafikasi/tipe
· Menilai kemajuan pengobatan
· Menentukan tingkat penularan
4. Pengumpulan sputum
Sputum ditampung dalam pot sputum yang bermulut lebar, berpenampang 6 cm, tutup berulir tidak mudah pecah dan bocor. Diagnosis ditegakkan dengan pemeriksaan 3 spesimen sputum Sewaktu Pagi Sewaktu(SPS). Dikumpulkan dalam 2 hari kunjungan yang berurutan.
Pelaksanaan pengumpulan sputum SPS.
S (sewaktu), sputum dikumpulkan pada saat suspek TB datang pertama kali. Pada saat pulang suspek membawa sebuah pot sputum untuk sputum hari kedua
P (pagi), sputum dikumpulkan di rumah pada pagi hari kedua segera setelah bangun tidur
S (sewaktu), sputum dikumpulkan di UPK pada hari kedua saat menyerahkan sputum pagi
5. Pewarnaan kuman BTA
· Ziehl Nielsen
· Tan Thiam Hok (kinyoun-gabbett)
· Auramin–phenol fluorochrome
6. Pewarnaan sediaan dengan metode Ziehl Nielsen
· Larutan Carbol Fuchsin 0,3%
· Asam alcohol (HCL – alcohol) 3%
· Methylen Blue 0,3%
Catatan penting :
Pewarnaan Ziehl Neelsen.
Larutan carbol fuchsin 0,3% dituang pada seluruh permukaan sediaan, kemudian dipanaskan diatas nyala api sampai keluar asap tetapi tidak sampai mendidih atau kering selama 5 menit (gunanya pemanasan agar zat tersebut dapat terserap kedalam sel sel kuman, sehingga kuman terwarnai jadi merah) . Sediaan kemudian dibiarkan dingin selama 5-7 menit lalu kelebihan zat warna dibuang dan dicuci dengan air yang mengalir perlahan. Setelah itu larutan asam alkohol 3% (hydrochloric acid-ethanol) dituang pada sediaan dan dibiarkan 2-4 menit kemudian dicuci dengan air mengalir selama 1-3 menit, kelebihan larutan dibuang (gunanya untuk melunturkan warna merah yang berlebihan zat A). Larutan methylene blue 0,1% dituang sampai menutup seluruh permukaan, dibiarkan 1 menit lalu larutan dibuang dan dicuci dengan air mengalir (MB gunanya sebagai zat penutup dan juga untuk mewarnai kuman lain) .
Pewarnaan Tan Thiam Hok.
Larutan Kinyoun (fuchsin basis 4g, fenol 8ml, alkohol 95% 20ml, H2O destilata (100ml) dituang pada permukaan sediaan, dibiarkan selama 3 menit, kemudian kelebihan zat warna dibuang dan dicuci dengan air yang mengalir perlahan. Selanjutnya larutan Gabbet (methylene blue 1g, H2SO4 96% 20ml, alkohol absolut 30ml, H2O destilata 50ml) dituang pada permukaan sediaan, dibiarkan 1 menit kemudian kelebihan zat warna dibuang dan dicuci dengan air yang mengalir perlahan, kemudian sediaan dikeringkan di udara
Pewarnaan Fluorokrom (Auramine O).
Sediaan direndam didalam larutan Auramine (Merck), dibiarkan selama 15 menit kemudian dicuci dengan air bebas klorin atau H2O destilata dan dikeringkan. Sediaan lalu direndam didalam asam alkohol, dibiarkan selama 2 menit, dicuci dengan H2O destilata dan dikeringkan. Setelah itu sediaan direndam didalam potasium permanganat 0,5%, dibiarkan selama 2 menit, dicuci dengan H2O destilata dan dikeringkan di udara .
7. Pembacaan hasil
Pembacaan hasil. Sediaan dilihat dibawah mikroskop dengan pembesaran 1000x dengan meneteskan minyak emersi tanpa menyentuh sediaan untuk mencegah transfer BTA antar sediaan. Pelaporan jumlah BTA sesuai dengan skala IUATLD (International Union Againts Tuberculosis and Lung Diseases, lihat Tabel 1).
- Basil tahan asam berwarna merah
- Basil tidak tahan asam berwarna biru
- SPS. Menurut Depkes bila 2 dari 3 spesimen tersebut hasilnya BTA (+) à TB
- Pembacaan hasil dengan menggunakan skala IUATLD:
· Negatif (-), tidak ada BTA dalam 100 lapangan pandang
· Meragukan (ditulis jumlah kuman yang ditemukan), 1-9 BTA dalam 100 lapangan pandang
· Positif 1 (+), 10 – 99 BTA dalam 100 lapangan pandang
· Positif 2 (++), 1-10 dalam 1 lapangan pandang minimal dibaca 50 lapang pandang
· Positif 3 (+++), >10 BTA dalam 1 lapangan pandang minimal dibaca 20 lapang pandang
catatan:
Bila ditemukan 1 – 3 BTA dalam 100 lapang pandang, pemeriksaan harus diulang dengan spesimen dahak yang baru. Bila hasilnya tetap 1-3 BTA hasilnya dilaporkan negatif. Bila ditemukan 4-9 BTA dilaporkan positif.
8. Tes Serologi
Tes serologi yang dapat membantu diagnosis tuberkulosis adalah tes takahashi. Tes ini merupakan reaksi aglutinasi fosfatida kaolin pada seri pengenceran serum sehingga dapat ditentukan titernya. Titer lebih dari 128 dianggap positif yang berarti proses tuberkulosis masih aktif.
MAJALAH KEDOKTERAN ANDALAS NO.1.VOL.24. 2000 HAL 21-31 Dr. ERLY INDRAMA, Sp.MK (K)
KULTUR KUMAN TBC :
Cara kerja :
1. Kumpulkan sputum penderita (sputum pagi) lakukan homogenasi dan dekontaminasi dengan Natrium Hidroksida 4%, aduk selama 2 menit. Tindakan ini dilakukan untuk membunuh kuman lain selain Mycobacterium.
2. Tambahkan NaCl fisiologis untuk pengenceran dan aduk hingga rata, biarkan 30 menit.
3. Dengan menggunakan pipet, ambil ± 2cc suspensi dan masukkan ke dalam media Ogawa 3%.
4. Inkubasi pada suhu 35ºC - 37°C dan hindarkan terkena cahaya matahari.
5. Setelah di inkubasi 5 – 7 hari, media yang telah ditanami mulai di baca dan catat hari pertama pertumbuhan koloni semenjak penanaman.
6. Jika setelah 8 minggu tidak terlihat pertumbuhan maka kultur di anggap negatif dan boleh di buang.
Test Resistensi Anti Tuberkulosis
Untuk mendapatkan konsentrasi INH (0.1, 1.0, 5.0) dilakukan prosedur berikut :
a. 1 mg INH dilarutkan dalam 10 ml Aquadest steril sehingga didapatkan konsentrasi INH 100 ug/ml (larutan A).
b. INH 0.1 ug : 0.1 ml larutan A (konsentrasi 100 ug/ml) + 100 ml medium.
c. INH 1 ug : 1 ml larutan A + 100 ml medium.
d. INH 5 ug : 5 ml larutan A + 100 ml medium.
Untuk mendapatkan konsentrasi Rifampicin (2.0, 10.0, 50.0 ug) dilakukan prosedur berikut :
a. 10 mg Rifampicin dilarutkan dalam 10 ml Aquadest steril, sehingga didapatkan konsentrasi Rifampicin 1000 ug/ml (larutan B).
b. Rif 2.0 ug : 0.2 ml larutan B + 100 ml medium.
c. Rif 10 ug : 1 ml larutan B + 100 ml medium.
d. Rif 50 ug : 5 ml larutan B + 100 ml medium.
Untuk mendapatkan konsentrasi Ethambutol (1.0, 5.0, 10.0 ug/ml) dilakukan prosedur berikut :
a. 10 mg Ethambutol dilarutkan dalam 10 ml Aquadest steril, sehingga didapatkan konsentrasi Ethambutol 1000 ug/ml (larutan C).
b. Eth 1.0 ug : 0.2 ml larutan C + 100 ml medium.
c. Eth 5.0 ug : 0.5 ml larutan C + 100 ml medium.
d. Eth 10 ug : 1 ml larutan C + 100 ml medium.
Untuk mendapatkan konsentrasi Pyrazinamid (30, 150, 750 ug/ml) dilakukan prosedur berikut :
a. 100 mg Pyrazinamid dilarutkan dalam 10 ml Aquadest steril, sehingga didapatkan konsentrasi Ethambutol 10.000 ug/ml (larutan D).
b. P 30 ug : 0.3 ml larutan D + 100 ml medium.
c. P 150 ug : 1.5 ml larutan D + 100 ml medium.
d. P 750 ug : 7.5 ml larutan D + 100 ml medium.
Suspensi Kuman
Suspensi kuman di buat dengan prosedur berikut :
1. Ambil 1 o'se koloni kuman dari medium Ogawa 3% dan masukkan ke dalam NaCl fisiologis, aduk hingga homogen, hingga dicapai kekeruhan dengan standart Mc Farland I (larutan A).
2. Lakukan pengenceran 1/1000, dengan cara mengambil 0.01 ml larutan A dan masukkan ke dalam 10 ml NaCl fisiologis, sehingga didapatkan kuman dengan konsentrasi pengenceran 1/1000 (larutan B), larutan ini akan digunakan sebagai kontrol.
3. Untuk larutan obat, digunakan suspensi kuman dengan pengenceran 1/100, di lakukan dengan cara mengambil 0.1 ml larutan A dan masukkan ke dalam 10 ml NaCl fisiologis (larutan C).
4. Pada medium kontrol, masukkan 2 tetes suspensi kuman dengan konsentrasi 1/1000 (larutan B) dan pada medium obat masukkan 2 tetes suspensi kuman dengan konsentrasi 1/100 (larutan C).
5. Lihat pertumbuhan kuman.
6. Tingkat resistensi di hitung berdasarkan perbandingan antara jumlah koloni yang tumbuh pada medium kontrol dengan medium tanpa obat (metoda proporsional).
Prof.DR.Dr. Agus syahrurrahman, Sp.MK (K) (diagnosis ”Multidrugs Resisten mycobacterium” TB
Cara membaca tabung MGIT( KUSDARMADJI ,TESIS UNDIP 2000)
LAMPIRAN MENGENAI MEDIA LOWENSTEIN-JEENSEN
Lowenstein Jensen adalah media yang digunakan untuk isolasi dan budidaya micobakterium dan sebagai basis untuk selektif, diferensial dan media diperkaya untuk Micobacterium tuberculosis.
Sebelum kita mengetahui mengenai media Lowenstein Jensen, terlebih dahulu kita juga harus tahu mengenai bakteri Micobacterium tuberculosis :
M.tuberculosis adalah kelompok bakteri di dalam famili Micobacteriaceae dan ordo Actinomycetales dan enus Micobacterium. Bakteri ini penyebab penyakit tuberculosis, bersifat tahan asam dan sukar diwarnai. berbentuk batang lurus dengan panjang 1-4um dan lebar antara 0,2-0,5um. Pewarnaan yang berguna untuk melihat morfologi bakteri ini adalah pewarnaan tahan asam, misalnya pewarnaan Zeihl Neelsen ataupun Kinyon Gabbet
Prinsip media Lowenstein Jensen
Lowenstein-Jensen menggunakan malasit green untuk menghambat bakteri lain kemudian memodifikasi dengan citrate dan phosphate. Komposisi dari asam fatty dan protein esensial untuk metabolisme bakteri. Glyserol bersumber dari carbon dan energi yang dibutuhkan untuk type human tubercle bacillus dari pada bovine type. Asparagin dan RNA ditumbuhkan untuk menyediakan sumber nitrogen dan stimulant pertumbuhan coagulasi dari albumin telur selama proses. Inspirasi menyediakan medium solid untuk inokulasi cultur specimen dari mikroba selalu berisi campuran contaminasi mikroorganisme sehingga mengharuskan menggunakan antibiotic selektif di dalam media untuk isolasi.
Asam nalidixic menghambat bakteri gram(-). Lincomycin menghambat gram (+). Cycloheximide menekan jamur saprofit.
Koloni yang tumbuh pada media Lowenstein Jensen
Bakteri tahan asam yang saprofit dapat tumbuh dengan baik bila ditanam pada medium yang sederhana pada suhu kamar. Sebaliknya, bakteri tahan asam yang patogen tidak dapat tumbuh pada media yang sederhana, tetapi hanya dapat tumbuh secara lambat pada media yang mengandung inspissated serum, telur, dan tepung kentang. Bakteri M.tubberculosis tumbuh baik pada pH optimal 6,8.
Koloni M.tuberculosis berwarna krem, permukaannya tidak rata atau berdungkul dungkul seperti bunga kubis kering. Koloni mikrobacteria yang patogen akan berbau seperti aroma buah. Pemberian gliserol juga bisa merangsang pertumbuhan M.tuberculosis
Komposisi media Lowenstein Jansen
Dalam 600 ml air mengandung :
1. Lowenstein jensen medium
Asparagine 3,60 gØ
Monopotasium phosphate 2,50 gØ
Magnesium citrate 0,50 gØ
Magnesium sulfate 0,24 gØ
Potato flour 30,00 gØ
Malasit green 0,40 gØ
Egg(fresh,whole) 1000,00 mlØ
Glyserol 12,00 gØ
2. Lowenstein jensen dengan 5% sodium cloride
Sama dengan prosedur no 1 hanya ditambah dengan 80,0 g sodium chloride
3. Lowenstein jensen dengan micobacterium selective
Sama dengan prosedur no 1 hanya ditambah dengan Cycloheximide 0,64g, Lincomicin 3,2mg, dan asam nalidixic 56,0 mg
4. Lowenstein jensen Gruft modification
Sama dengan prosedur no 1 hanya ditambah dengan 56,0 mg asam nalidixic dan 80 mg RNA
Cara pembuatan :
1.Campur 37,4 g bubuk dalam 600 ml air murni berisi 12 mL gliserol.
Jangan menambahkan gliserol jika Tuberkulum basil tipe bovine atau organisme glycerophobic lainnya untuk dibudidayakan. Aduk rata.
2.Panaskan dengan sampai media mendidih.
3.Autoclave pada 121°C selama 15menit. dinginkan kira-kira suhu 50 ° C.
4.Sementara itu, siapkan 1.000 ml seluruh telur dikumpulkan aseptik dan dicampur secara merata, tanpa ada gelembung udara.
5.Mempercampurkan media dasar dan telur perlahan sampai campuran merata dan tanpa gelembung udara.
6.Masukkan dalam wadah steril yang sesuai tutup tabung.
7.Atur tabung dalam posisi miring, biarkan mengental dan mengental pada 85 ° C selama 45 menit.
8.Uji sampel produk jadi untuk kinerja dengan menggunakan stabil dan cultur kontrol.
Penyimpanan :
Setelah menerima simpan pada suhu 2-8⁰C pada tempat gelap. Media tidak boleh digunakan jika ada kontaminasi, keburukan (menyusut, pecah, atau perubahan warna) dan sudah kadaluarsa.
Biakan M.tuberculosis yang disimpan pada suhu 37⁰C tetap hidup tanpa kehilangan virulensinya selama 12 tahun, tapi bila terkena matahari secara langsung perbenihan dalam meia akan mati dalam waktu 2-3 jam.
Perbedaan LOWENSTEIN JENSEN dengan KUDOH
1. Medium LOWENSTEIN-JENSEN Mengandung telur, gliserol,garam mineral, hijau malachite,biasanya dicampurkan Penicillin untuk membunuh kuman penyerta.
2. Medium KUDOH Mirip diatas tetapi tidak mengandung Asparagin Lebih baik, murah, kemungkinan untuk memperoleh biakan positive lebih besar.
Media lain yang dapat digunakan untuk isolasi M.tuberculosis
Media Petragnani (media ini mengandung tepung kentang, gliseryn dan telur)v
Media Middlebrookv
Media Sulav
Media Tharsisv
Komentar
Posting Komentar